2020年6月，the Tabula Muris Consortium在《Nature》杂志上发表了题为“A single-cell transcriptomic atlas characterizes ageing tissues in the mouse”的文章。文中报道了随衰老变化的小鼠体内详细的分子和细胞类型特异性的细胞图谱，为细胞生物学研究领域提供了一个有关分子和细胞类型特异性的衰老“画像”，阐述了表型和生理学的深层特征，并为理解哺乳动物在其生命周期中发生的细胞生物学变化提供了参考。
衰老的特征是逐渐丧失生理完整性，导致功能受损，增加死亡的可能性。为了更好的了解衰老过程，文章的作者们绘制了一个包含23个组织和器官，横跨小鼠生命周期的单细胞转录组图谱。
研究结果表明多种细胞类型和器官都发生了细胞特异性变化，不同器官的细胞组成也发生了与月龄相关的变化。利用单细胞转录组数据，作者评估了不同月龄特征的细胞特异性表现，如衰老、基因组不稳定性和免疫系统的变化。本研究的结果（作者们将其命名为 Tabula Muris Senis），揭示了在广泛的组织和细胞类型之中，与衰老相关的重要标志是如何表现的。
作者们对来自6个不同月龄组的雄性和雌性C57BL/6JN小鼠的35万多个细胞进行了单细胞RNA测序，小鼠的月龄跨度为从1月龄（相当于人类早期儿童）到30月龄（相当于人类百岁老人）(图 1a)。
图 1a 对19只雄性小鼠和11只雌性小鼠的23个器官在6个不同时间点进行分析。
样品涉及小鼠的膀胱、骨髓和大脑（小脑、皮质、海马和纹状体）、脂肪（棕色、性腺、肠系膜和皮下）、心脏和主动脉、肾脏、大肠、四肢肌肉和膈肌、肝脏、肺、乳腺、胰腺、皮肤、脾脏、胸腺、舌和气管。采用液滴微流控技术（microfluidic droplets）收集所有6个月龄组的数据，使用荧光激活细胞分选技术(FACS)选择3月龄、18月龄和24月龄组的单细胞进行分选。
基于单细胞测序数据能够揭示大量实验中观察到的样品基因表达变化的原因，是由于群体中每个细胞的基因表达变化引起的，还是每个细胞的基因表达保持不变而该类型的细胞数量发生了改变，或者两者都有参与。Cdkn2a及其蛋白产物p16是衰老的重要标志之一，在实验中以此为例研究了表达Cdkn2a的细胞是如何随月龄而变化的。结果表明，高龄小鼠中表达Cdkn2a的细胞比例比年轻小鼠高出一倍以上(图2a-b)，同时p16在其表达的细胞中表达水平增加了两倍(图2c-d)。
通过实验发现，随着月龄的增长，膀胱细胞类型的组成出现了明显的变化(图2e)，膀胱间叶组织的细胞类型减少了三倍，尿路上皮细胞类型增加了相似的数量。月龄相关的肾脏变化包括系膜细胞、毛细血管内皮细胞、髓袢升支上皮细胞和髓袢升支粗段上皮细胞的相对丰度减少。系膜细胞和毛细血管内皮细胞都是肾小球的核心细胞，它们的相对丰度随着月龄的增长而减少（图2g上），同时组织范围内Egf和Atp1a1表达减少（图2h），提示肾小球滤过率受损。在脾脏中，T细胞的比例随着月龄的增长而减少，而浆细胞的相对数量则增加（图2i）。同样，在乳腺中T细胞数量随着月龄的增长而下降。肝脏的组织结构也随着月龄的增长而变化，随着月龄增长，肝细胞相对数量减少。白蛋白表达的减少支持了这一观点。
图2 在衰老过中的细胞变化
2a和2b柱状图分别展示了采用FACS和droplet分析方法中不同月龄表达Cdkn2a的细胞的比例；2c和2d柱状图分别展示了采用FACS和droplet分析方法中的不同月龄表达Cdkn2a的细胞中该基因表达水平的中位数；2e展示了膀胱细胞（左）和尿路上皮细胞（右）相对丰度随着月龄增长显著变化；2f展示了将月龄作为连续的协变量时，膀胱中上调和下调的top20基因；2g展示了肾脏毛细血管内皮细胞(左上)、系膜细胞(右上)、髓袢升支上皮细胞(左下)和髓袢升支粗段上皮细胞(右下)的相对丰度随月龄变化显著；2h展示了将月龄作为连续的协变量时，肾脏中上调和下调的top20基因；2i展示了脾脏浆细胞(左)和脾脏T细胞(右)的相对丰度随着月龄增长变化显著；2j展示了将月龄作为连续的协变量时，脾脏中上调和下调的top20基因。
基因组不稳定性是研究最为广泛的衰老特征之一。全长转录本数据可以研究随着月龄增长而积累的体细胞突变。通过观察特定组织中，在每个月龄组至少覆盖75%的细胞的表达基因，发现所有观察的组织中与月龄相关的突变数量均增加，其中舌和膀胱是受影响大的。
衰老也会影响免疫系统。实验中分别使用单细胞成像和示踪剂对FACS数据中出现的B细胞和T细胞受体的序列进行了计算重建，分析了整个机体B细胞和T细胞之间的克隆关系(图4a-b)。通过进一步对B细胞和T细胞库克隆性的变化的分析计算发现，24月龄的小鼠的免疫系统不太可能对新的病原体做出反应，这也支持了早期文献报道的老年人较年轻人对新感染的易感性更高，接种疫苗的益处更低的观点。
最后，作者们计算了一个整体多样性评分，以确定哪种细胞类型更容易受月龄变化的影响。结果表明起源于大脑和肾脏的免疫系统细胞多样性发生显著变化(图4c)。在脑中，大多数年轻的(3月龄)小胶质细胞聚集于簇1和6，而衰老的(18月龄和24月龄)小胶质细胞聚集于簇10，12和14(图4d)。与簇1和6相比，簇10，12和14富含干扰素反应或监管的基因，这表明在衰老的大脑中，小胶质细胞的这个小的促炎亚群有扩张的趋势。此外，“年轻”和“年老”簇间差异表达基因的列表与之前报道的阿尔茨海默病特异性小胶质细胞特征相似。在差异表达基因方面，二者前200个差异表达基因中有55个是相同的(图4e)。肾巨噬细胞方面，实验中发现两个簇的细胞的组成随月龄发生显著变化。簇10主要由1月龄和3月龄小鼠的细胞组成，而簇13主要由18月龄、21月龄、24月龄和30月龄的小鼠的细胞组成(图4f)。基因的差异表达分析表明簇10的细胞富含M2巨噬细胞的基因标记，而簇13的细胞类似于M1促炎巨噬细胞的状态。
图4 免疫系统的衰老
4a展示了B细胞克隆家族，其中饼状图显示了3月龄、18月龄和24月龄的单克隆B细胞和属于克隆家族的B细胞的比例；4b展示了T细胞克隆家族，其中饼状图显示了3月龄，18月龄和24月龄的单克隆T细胞和属于克隆家族的T细胞的比例；4c展示了随月龄变化显著的两种细胞类型的多样性得分；4d展示了按月龄标记的脑小胶质细胞Leiden聚类的UMAP图；4e展示了使用小胶质细胞阿尔茨海默病标记进行评分的脑小胶质细胞UMAP图；4f展示了按月龄标记的肾巨噬细胞Leiden聚类的UMAP图。
参考文献：
Tabula Muris Consortium. A single-cell transcriptomic atlas characterizes ageing tissues in the mouse. Nature. 2020 Jul;583(7817):590-595. doi: 10.1038/s41586-020-2496-1. Epub 2020 Jul 15. PMID: 32669714; PMCID: PMC8240505.
